Métodos de Esterilización

La esterilización en olla de presión es el método estándar para spawn de grano, aserrín suplementado, tortas BRF, agar y cultivo líquido. Carga tus frascos o bolsas sobre una rejilla dentro de la olla de presión — nunca los coloques directamente en el fondo, o pueden agrietarse por el calor directo. Añade 5-8 cm de agua en el fondo (suficiente para que no se evapore durante la cocción prolongada).

Coloca la tapa y asegúrala según las instrucciones de tu olla. Calienta a fuego alto hasta que la olla alcance 15 PSI (103 kPa), lo que corresponde a una temperatura interna de 121°C (250°F). Comienza tu temporizador solo cuando se alcancen los 15 PSI.

Tiempos de esterilización estándar:

• Frascos de un cuarto de grano: 90 minutos
• Frascos de media pinta de BRF: 60 minutos
• Bolsas de aserrín suplementado (2 kg): 150 minutos
• Placas de agar: 45 minutos
• Cultivo líquido: 30 minutos

Mantén presión constante durante todo el proceso — si cae por debajo de 15 PSI, reinicia el temporizador. Después de la cocción, apaga el fuego y deja que la olla se despresurize naturalmente durante 4-8 horas. Nunca la enfrías forzadamente. El enfriamiento lento evita que los frascos se agrieten y evita succionar aire contaminado de vuelta a los recipientes.

Ambos logran el mismo objetivo — 121°C (250°F) a 15 PSI — pero difieren en diseño y confiabilidad.

Una olla de presión de cocina estándar (la Presto de 23 cuartos es la más popular en micología) cuesta $80-150 y funciona bien para cultivadores a escala casera. Usa un peso oscilante o manómetro para mantener la presión y requiere monitoreo manual.

Un autoclave es un dispositivo de esterilización construido específicamente con una puerta de cierre, controles automatizados de presión y temperatura, y un ciclo de secado. Los autoclaves de grado de laboratorio cuestan $2,000-15,000+ y son excesivos para la mayoría de los cultivadores caseros.

Para propósitos prácticos, una olla de presión de calidad a 15 PSI por la duración correcta esteriliza tan efectivamente como un autoclave. Las principales ventajas de un autoclave son la consistencia (controles automatizados previenen caídas de presión), capacidad (cámara más grande) y un ciclo de secado post-esterilización que remueve condensación de los recipientes. Si estás eligiendo una olla de presión para micología, consigue una que contenga al menos 23 cuartos (22 L) — esto cabe 7-10 frascos de un cuarto por carga. Evita las ollas de presión eléctricas (Instant Pot) ya que la mayoría no pueden mantener verdaderos 15 PSI.

Todos los tiempos listados son a 15 PSI (121°C / 250°F), comenzando solo después de que se alcanza la presión completa:

• Spawn de grano en frascos de un cuarto: 90 minutos
• Spawn de grano en frascos de medio galón: 120 minutos
• Spawn de grano en bolsas de 2 kg: 120-150 minutos
• Tortas BRF en frascos de media pinta: 60 minutos
• Aserrín suplementado (Masters Mix) en bolsas de 2 kg: 150 minutos
• Aserrín de madera dura simple en bolsas de 2 kg: 90 minutos
• Medios de agar en placas Petri o frascos: 45 minutos
• Cultivo líquido en frascos de pinta: 30 minutos
• Cultivo líquido en frascos de un cuarto: 45 minutos
• Sustrato en bolsas de 5 kg: 180 minutos (mínimo)

Estos tiempos contemplan la penetración de calor — volúmenes más grandes necesitan más tiempo porque el centro tarda más en alcanzar la temperatura de esterilización. Nunca reduzcas estos tiempos. Si acaso, añade 15-30 minutos como margen de seguridad, especialmente para sustratos densos empacados firmemente en bolsas. Los cultivadores que experimentan contaminación en una configuración por lo demás limpia deberían aumentar el tiempo de esterilización en 30 minutos antes de investigar otras variables. Es mucho mejor sobre-esterilizar que sub-esterilizar.

Usa bolsas de cultivo de polipropileno autoclavable clasificadas para 121°C (vendidas como bolsas de cultivo de hongos o bolsas de autoclave con parche de filtro). Llena la bolsa con sustrato hidratado — típicamente 1.5-2.5 kg por bolsa. Deja 10-15 cm de espacio vacío sobre el sustrato para la expansión durante el calentamiento.

Pasos de preparación:

• Dobla la parte superior de la bolsa y asegura con un clip de doblez, brida o selladora de impulso
• No selles la bolsa completamente hermética — el parche de filtro proporciona intercambio de gases, pero si tu bolsa no tiene parche de filtro, deja una pequeña abertura para que escape el vapor
• Coloca las bolsas verticalmente en la olla de presión, no tan apretadas que el vapor no pueda circular entre ellas
• Funciona a 15 PSI por 150 minutos para sustratos suplementados (Masters Mix, aserrín suplementado con salvado) o 90 minutos para sustratos simples

Después de la despresurización natural y enfriamiento (8-12 horas), las bolsas están listas para inoculación. Inocula frente a un flujo laminar o dentro de una cámara de aire quieto cortando una pequeña hendidura en la bolsa, insertando spawn y sellando la hendidura con cinta microporosa o una selladora de impulso.

Usa frascos de vidrio de boca ancha de un cuarto (946 ml). Modifica las tapas: perfora o taladra un agujero de 12 mm en el centro de cada tapa metálica. Cubre el agujero por dentro con un disco de cinta microporosa (cinta quirúrgica 3M Micropore) o inserta una pequeña cantidad de polyfill por el agujero. Esto proporciona intercambio de gases mientras filtra los contaminantes.

Pasos de carga y esterilización:

• Llena los frascos a tres cuartos con grano preparado y seco en la superficie
• Limpia el borde del frasco para asegurar un buen sello
• Coloca la tapa modificada en el frasco y ajusta el anillo a presión de dedos — no completamente ajustado, ya que algo de aire necesita escapar durante el calentamiento
• Cubre la tapa con un cuadrado de papel aluminio para evitar que el agua gotee sobre la cinta microporosa
• Coloca los frascos sobre una rejilla en la olla de presión (una rejilla de conservas, anillo de frasco o toalla doblada funciona)
• Añade 5-8 cm de agua en el fondo
• Esteriliza a 15 PSI por 90 minutos

Después del enfriamiento natural (8-12 horas), los frascos están listos. Inocula frente a un flujo laminar o dentro de una SAB levantando el aluminio, inyectando solución de esporas o cultivo líquido a través de la cinta microporosa usando una aguja esterilizada a la llama.

Técnicamente, no puedes lograr una verdadera esterilización (matar todas las endoesporas) sin alcanzar 121°C, lo cual requiere presión. Sin embargo, existen alternativas para cultivadores sin olla de presión.

La mejor opción es la esterilización fraccionada (tindalización): vaporiza tu sustrato a 100°C durante 60 minutos, luego déjalo reposar a temperatura ambiente durante 24 horas. Repite este ciclo tres veces durante tres días. La teoría es que las endoesporas resistentes al calor germinan durante los períodos de reposo a temperatura ambiente y luego son eliminadas por el siguiente ciclo de vaporización. Este método es más lento y menos confiable que la cocción a presión pero funciona para muchos cultivadores. Vaporiza a presión atmosférica (100°C) usando una olla grande con rejilla y tapa ajustada.

Otra opción: usa sustratos bajos en nutrientes que solo requieren pasteurización (CVG, paja simple, fibra de coco pura) y evita cualquier sustrato que necesite esterilización. Esto elimina la necesidad de una olla de presión por completo pero limita tus opciones de sustrato.

Para spawn de grano específicamente, no hay sustituto confiable para la cocción a presión. Si quieres hacer tu propio spawn de grano, invierte en una olla de presión — una Presto de 23 cuartos cuesta aproximadamente $80-100 y es la pieza de equipo de micología más importante.

La tindalización es un método de esterilización de sustrato sin olla de presión que usa ciclos repetidos de vaporización a presión atmosférica. El proceso explota el ciclo de vida de las endoesporas bacterianas — las estructuras dormantes resistentes al calor que sobreviven a la ebullición normal.

El protocolo:

• Día 1: Vaporiza el sustrato a 100°C (ebullición / vapor atmosférico) durante 60-90 minutos. Esto mata todas las bacterias activas y mohos pero deja las endoesporas vivas. Retira del calor y deja reposar a temperatura ambiente (20-25°C) durante 24 horas. Durante este descanso, las endoesporas sobrevivientes germinan en bacterias activas, ahora vulnerables al calor.
• Día 2: Vaporiza de nuevo a 100°C durante 60-90 minutos, matando las bacterias recién germinadas. Descansa durante otras 24 horas.
• Día 3: Vaporiza una tercera y última vez. Para este tercer ciclo, virtualmente todas las endoesporas deberían haber germinado y sido eliminadas.

La tindalización toma 3 días en lugar de 90 minutos y es menos confiable que la cocción a presión — algunas endoesporas pueden no germinar durante los períodos de descanso, especialmente si las temperaturas son demasiado frías. Mantén las temperaturas de descanso por encima de 20°C para mejores resultados. Este método funciona razonablemente bien para aserrín suplementado y BRF pero no se recomienda para spawn de grano.

Prepara tu receta de agar. Una receta común:

• Agua: 500 ml
• Extracto de malta claro: 10 g
• Polvo de agar: 10 g
• Levadura nutricional: 1 g

Mezcla todos los ingredientes en una botella o matraz de vidrio resistente al calor y tapa ligeramente (la tapa debe permitir que escape el vapor). Alternativamente, usa polvo de medios premezclados a la proporción recomendada por el fabricante.

Coloca la botella sobre una rejilla en tu olla de presión con 5-8 cm de agua en el fondo. Esteriliza a 15 PSI por 45 minutos. Después de que la olla de presión se despresurize naturalmente, retira cuidadosamente la botella mientras el agar aún está líquido (se solidifica por debajo de aproximadamente 45°C).

Trabajando frente a un flujo laminar o dentro de una cámara de aire quieto, vierte el agar líquido en placas Petri estériles, llenando cada placa aproximadamente un tercio (aproximadamente 15-20 ml por placa de 100 mm). Vierte rápido pero cuidadosamente — inclina la tapa de la placa lo suficiente para verter, luego reemplaza inmediatamente. Deja las placas reposar sin mover sobre una superficie nivelada durante 30-60 minutos hasta que el agar se solidifique. Almacena las placas vertidas boca abajo (agar arriba) en una bolsa sellada o funda a temperatura ambiente hasta 2 semanas, o refrigeradas hasta 2 meses.

El medio de cultivo líquido (LC) es un caldo rico en nutrientes usado para cultivar micelio en forma líquida para inoculación rápida. Recetas estándar (elige una):

• 600 ml de agua + 24 g de extracto de malta claro (solución al 4%)
• 600 ml de agua + 12 g de miel (solución al 2%)
• 600 ml de agua + 6 g de jarabe de maíz claro (solución al 1%)

Mezcla los ingredientes en un frasco de vidrio de un cuarto. Añade una pequeña canica de vidrio o barra magnética para ayudar a romper el micelio cuando agites el frasco más tarde. Modifica la tapa del frasco con un puerto de inyección autosellante (un punto de silicona de alta temperatura sobre un agujero perforado) y un puerto de intercambio de gases (cinta microporosa sobre un segundo agujero perforado). Cubre la tapa con papel aluminio.

Esteriliza a 15 PSI por 30 minutos (frasco de un cuarto) o 20 minutos (frasco de pinta). Tiempos de esterilización más cortos que el grano porque el medio líquido es menos denso y se calienta más rápido.

Después de enfriar durante 8-12 horas, inocula inyectando una pequeña cantidad de cultivo limpio (0.5-1 ml de LC o una pequeña cuña de agar) a través del puerto de inyección usando una jeringa esterilizada a la llama. La colonización toma 5-14 días a 21-24°C con agitación suave periódica para romper grumos de micelio.

Los fallos de esterilización más frecuentes:

• No alcanzar 15 PSI — las ollas de presión eléctricas (Instant Pot) frecuentemente alcanzan un máximo de 10-12 PSI, lo que alcanza solo 115°C en lugar de 121°C. Esto deja las endoesporas vivas. Usa una olla de presión de estufa que alcance confiablemente 15 PSI.
• Comenzar el temporizador demasiado pronto — el cronometraje debe comenzar solo después de que la olla alcance los 15 PSI completos, no cuando comienza a acumular presión.
• Caídas de presión durante el ciclo — si la presión cae por debajo de 15 PSI en cualquier momento, el temporizador debe reiniciarse desde cero. Monitorea durante toda la duración.
• Demasiada humedad en el grano — incluso una esterilización perfecta no puede salvar grano que está demasiado húmedo. El exceso de humedad crea zonas anaeróbicas donde los termófilos sobrevivientes prosperan.
• Enfriamiento forzado de la olla de presión — pasar agua fría sobre la tapa o liberar la válvula de presión crea una caída repentina de presión que puede succionar aire contaminado de vuelta a los frascos. Siempre deja enfriar naturalmente.
• Sobrecargar la olla — empacar demasiados frascos impide la circulación de vapor y crea puntos fríos que nunca alcanzan 121°C. Deja espacio entre los frascos.
• Abrir frascos fuera de aire limpio — el sustrato esterilizado es máximamente vulnerable. Solo abre frente a un flujo laminar o dentro de una SAB.