Transferencias y Aislamiento

Esteriliza tu bisturí con llama hasta el rojo vivo, deja enfriar 5-10 segundos (tócalo al agar en el borde de la placa para verificar que no chisporroteará y matará tu cultivo). Corta una pequeña cuña (aproximadamente 5mm cuadrados) del borde de avance del crecimiento del micelio — el crecimiento más nuevo y vigoroso más alejado del centro.

El proceso de transferencia:

• Abre una placa fresca solo lo suficiente para deslizar la cuña adentro
• Colócala con el lado del agar hacia abajo en el centro
• Cierra la tapa y sella con parafilm
• Etiqueta con el nombre de la cepa, número de transferencia y fecha

El trozo transferido comenzará a crecer hacia afuera dentro de 2-3 días si el cultivo está saludable. Cada transferencia del borde de avance selecciona la genética de crecimiento más rápido.

Típicamente 3-5 transferencias del borde de avance para lograr un monocultivo limpio y aislado. Cada transferencia selecciona el individuo genético de crecimiento más rápido mientras deja atrás a los competidores más lentos y los contaminantes.

La progresión del aislamiento:

• Transferencia 1 — retira el sector más rápido de una placa multiespórica
• Transferencia 2-3 — continúa seleccionando el borde de avance más limpio y vigoroso
• Transferencia 4-5 — el crecimiento debería ser uniforme y consistente, un individuo genético dominando la placa

Sabes que el aislamiento está completo cuando el patrón de crecimiento se ve idéntico en transferencias consecutivas: misma velocidad, misma morfología, misma densidad. Si el crecimiento aún se ve variado (diferentes sectores con diferentes texturas o velocidades), sigue transfiriendo.

Un cultivo multiespórico es lo que obtienes cuando germinas esporas en agar — contiene muchos individuos genéticos diferentes creciendo juntos. Cada espora lleva una combinación genética única, así que una placa multiespórica es como un jardín con docenas de plantas diferentes compitiendo.

Un monocultivo (cepa aislada) es un único individuo genético que ha sido seleccionado a través de transferencias repetidas. Los monocultivos producen resultados predecibles y consistentes:

• Velocidad de colonización uniforme
• Formación de primordios consistente
• Rendimientos confiables cultivo tras cultivo

Los cultivos multiespóricos son genéticamente impredecibles — a veces obtienes genéticas excelentes, a veces pobres. Para cultivo de hobby, el multiespórico está bien. Para producción consistente, los monocultivos son esenciales.

En una placa multiespórica, verás múltiples sectores de micelio creciendo hacia afuera desde el punto de inoculación a diferentes velocidades y con diferentes morfologías.

Busca:

• El sector que alcanza el borde de la placa primero (colonizador más rápido)
• Crecimiento rizomórfico (hebras gruesas, tipo cuerda, que se extienden hacia afuera — indica genéticas fuertes y agresivas)
• Color blanco brillante sin decoloración
• Márgenes limpios sin halo bacteriano

Evita sectores con:

• Crecimiento solo tomentoso (peludo pero lento — aunque esto depende de la especie, ya que algunas como la melena de león son naturalmente tomentosas)
• Crecimiento irregular o con parches
• Cualquier decoloración
• Crecimiento que se detiene y reinicia

Marca tu sector elegido con un marcador en el fondo de la placa, luego corta de su borde de avance para tu transferencia.

Para la mayoría de las especies, selecciona crecimiento rizomórfico — las hebras gruesas, tipo cuerda, que se extienden agresivamente a través de la placa. El micelio rizomórfico coloniza más rápido, es más resistente a la contaminación y generalmente produce mejor formación de primordios.

Sin embargo, algunas especies son naturalmente tomentosas (peludas, tipo algodón):

• Melena de león
• Reishi
• Algunas variedades de ostra

Seleccionar crecimiento rizomórfico en una especie naturalmente tomentosa es luchar contra la biología. La clave es entender la morfología natural de tu especie. Para cubensis y la mayoría de las especies de Pleurotus, lo rizomórfico es el estándar de oro. Para Hericium (melena de león), lo tomentoso es perfectamente normal y saludable. Juzga el vigor por velocidad y densidad, no solo por morfología.

Trabaja frente a tu campana de flujo o dentro de tu SAB. Esteriliza tu bisturí con llama, deja enfriar. Raspa suavemente una cantidad diminuta de esporas de la impresión — necesitas mucho menos de lo que piensas, ya que cada impresión de esporas contiene millones de esporas.

El proceso de inoculación:

• Toca la punta del bisturí cargada de esporas al centro de una placa de agar fresca
• Arrástrala en un patrón ligero de zigzag a través de la superficie (esto distribuye las esporas para que los puntos individuales de germinación sean visibles en lugar de un grumo denso)
• Cierra y sella la placa

La germinación típicamente aparece dentro de 3-7 días como pequeños puntos blancos o parches peludos en la superficie del agar. Una sola impresión de esporas puede inocular docenas de placas.

Agita la jeringa vigorosamente durante 30 segundos para distribuir las esporas uniformemente. Esteriliza la aguja con llama hasta el rojo vivo, deja enfriar. Abre la tapa de la placa de Petri solo lo suficiente para insertar la aguja. Deposita una pequeña gota (aproximadamente 0.1ml) sobre la superficie del agar. Puedes colocar 2-3 gotas en diferentes puntos de la placa para múltiples puntos de germinación, pero una gota suele ser suficiente.

Cierra y sella. La germinación aparece en 3-7 días.

La ventaja de ir primero al agar (en lugar de directamente al grano) es que puedes verificar que la jeringa de esporas está limpia antes de comprometer spawn de grano. Si aparecen bacterias o moho en el agar, solo has perdido una placa en lugar de un frasco entero de grano.

La clonación de tejido captura la genética exacta de un hongo que quieres replicar. Selecciona un espécimen saludable e impresionante. Rompe (no cortes) el hongo por la mitad para exponer el tejido interior limpio.

El proceso de clonación:

• Usando un bisturí esterilizado con llama, corta un trozo diminuto (2-3mm) de tejido del interior del tallo, cerca de donde se encuentra con el sombrero — esta área tiene el menor riesgo de contaminación
• Coloca el trozo de tejido sobre una placa de agar fresca
• Sella con parafilm
• Dentro de 3-7 días, micelio blanco debería crecer hacia afuera desde el tejido

La primera transferencia de un clon a menudo está contaminada con bacterias del tejido del hongo, así que planea transferir a una placa fresca (o usa agar con antibiótico) una vez que el micelio esté establecido.

Clona del tejido interior del tallo, específicamente donde el tallo se encuentra con el sombrero. Esta ubicación es la mejor porque:

• Está lo más lejos de la superficie exterior (donde viven las bacterias y contaminantes)
• Es la parte del hongo que está creciendo más activamente
• El tejido es denso y firme (más fácil cortar un trozo limpio)

Nunca clones de la superficie del sombrero, tejido de las laminillas, o la base del tallo donde contactó el sustrato — estas áreas portan cargas microbianas pesadas.

La técnica: rompe el hongo por la mitad con manos limpias para exponer el interior sin introducir contaminantes de la superficie mediante un corte con cuchillo. Trabaja rápidamente — cuanto más tiempo esté expuesto el interior al aire, más contaminantes se depositan en él.

Clona cuando tengas un hongo específico con rasgos que quieras preservar. Usa esporas cuando necesites diversidad genética o no tengas un hongo fresco con el cual trabajar.

Clona cuando:

• Tengas un hongo excepcionalmente productivo y quieras genéticas idénticas
• Quieras preservar las características de una cepa específica (rendimiento, velocidad, morfología)
• Necesites un camino rápido a un monocultivo limpio (la clonación omite el proceso de aislamiento)

Usa esporas cuando:

• No tengas un hongo fresco del cual clonar
• Quieras diversidad genética (criar nuevas variedades)
• Estés comenzando con una nueva especie y no tengas cultivos existentes
• Quieras explorar la variación natural dentro de una especie

La clonación es más rápida (una muestra de tejido a cultivo limpio en 1-2 transferencias) mientras que el aislamiento de esporas es más lento (germinación multiespórica a 3-5 transferencias para aislar). La mayoría de los cultivadores experimentados usan una combinación: esporas para genéticas nuevas, clonación para preservar ganadores.

Cualquier color que no sea blanco creciendo en la placa es una señal de alarma — verde, azul-verdoso, negro, amarillo, anaranjado o rosa, todos indican contaminación.

Señales de contaminación en un cultivo de agar:

• Estrías bacterianas húmedas o brillantes cerca o alrededor del micelio
• Márgenes de crecimiento irregulares que se ven diferentes del lado limpio del cultivo
• Un patrón de sectorización donde un área crece diferente (diferente textura, velocidad o color)
• Un olor agrio o desagradable cuando abres brevemente la placa

Si la contaminación es menor y localizada, puedes rescatar el cultivo: corta un pequeño trozo de micelio limpio del borde de avance más alejado de la contaminación y transfiérelo a una placa fresca. Si la contaminación es generalizada o ves múltiples tipos, comienza de nuevo — el cultivo está comprometido.